单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的
来源:学生作业帮助网 编辑:作业帮 时间:2024/07/02 07:29:50
![单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的](/uploads/image/z/8698468-4-8.jpg?t=%E5%8D%95%E9%85%B6%E5%88%87%E9%97%AE%E9%A2%98%E5%8D%95%E9%85%B6%E5%88%87%E5%A4%A7%E5%B0%8F%E7%BA%A65000bp%E7%9A%84%E8%B4%A8%E7%B2%92pcDNA3.1%2C%E7%94%B5%E6%B3%B3%E6%80%BB%E6%98%AF%E5%87%BA%E7%8E%B0%E4%B8%A4%E6%9D%A1%E5%B8%A6%2C%E8%AF%B4%E6%98%AF%E9%85%B6%E5%88%87%E4%B8%8D%E5%AE%8C%E5%85%A8%2C%E8%B0%83%E6%95%B4%E6%88%9020ul%E4%BD%93%E7%B3%BB%2C%E9%85%B62ul%2C%E8%B4%A8%E7%B2%928ul%2Cbuffer+4ul%2C%E7%BB%93%E6%9E%9C%E4%BB%8D%E6%98%AF%E4%B8%A4%E6%9D%A1%E5%B8%A6%2C%E5%9C%A85000bp%E5%B7%A6%E5%8F%B3%2C%E5%BE%88%E7%9B%B8%E8%BF%91.%E7%A9%B6%E7%AB%9F%E4%BB%80%E4%B9%88%E9%97%AE%E9%A2%98%2C%E6%9C%9F%E5%BE%85%E9%AB%98%E4%BA%BA%E6%8C%87%E7%82%B9%2C%E9%85%B6%E7%94%A8%E7%9A%84)
单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的
单酶切问题
单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的是TAKALA的Ssp1.
顺便想问酶切后的质粒要与目的片段连接,是否需要进行胶回收纯化呢.查有篇文献构建该质粒时并没提到胶回收纯化,新手很多问题都不大懂,感谢大家关注
单酶切问题单酶切大小约5000bp的质粒pcDNA3.1,电泳总是出现两条带,说是酶切不完全,调整成20ul体系,酶2ul,质粒8ul,buffer 4ul,结果仍是两条带,在5000bp左右,很相近.究竟什么问题,期待高人指点,酶用的
首先明确一个问题,你的这个酶切位点在这个质粒中是唯一的吗,也就是说你只想把这个质粒切开吗?看你的结果好象这种可能性大些,那样我觉得最有可能是梅切不完全,即切开的线形质粒会比未切开的质粒跑得慢但两条带很相近.
建议:首先电泳时要有原质粒作对照,这样你就可以确定跑得快的带是不是未完全切开的质粒了.其次想酶切完全,可延长梅切时间,看你的体系酶的量足够了,而且酶的量本身也不应大于1/10;只是不知梅切的时间.最后若是可以确定两条带中有一条是切开的,则可以利用胶回收纯化的方法得到所需的这一载体,在和目的片段连接,注意这时凝胶回收是必要的,但若两条带太相近,则可能切的时候难分离;若是改变实验条件最终完全梅切(只一条带,且和原质粒位置有差异),则可以用加热65度20分钟的(对于37度酶)方法将酶灭活直接用作连接载体即可,不用回收.
以上是假设你的载体这个酶切位点唯一的情况,若不是则会切下一小段片段,并且一定要凝胶回收才可得到连接载体.